锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体亚博电竞唯一官网激酶亚博电竞唯一官网体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB亚博电竞唯一官网ELISA亚博电竞唯一官网甲基化亚博电竞唯一官网SNP亚博电竞唯一官网高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8亚博电竞唯一官网流式周期亚博电竞唯一官网流式凋亡亚博电竞唯一官网流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)亚博电竞唯一官网线粒体膜电位亚博电竞唯一官网transwell亚博电竞唯一官网管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光亚博电竞唯一官网稳转株构建双荧光素酶亚博电竞唯一官网细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)亚博电竞唯一官网酶活动力学亚博电竞唯一官网HDA亚博电竞唯一官网细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学亚博电竞唯一官网服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查亚博电竞唯一官网全外显子组基因亚博电竞唯一官网其他疾病基因亚博电竞唯一官网生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡亚博电竞唯一官网自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

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动物实验、载体构建、细胞实验、病理学亚博电竞唯一官网、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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稳转株构建

Stable strain



实验原理


在基因功能的研究中,将目的基因有效导入靶细胞,是功能研究的前提条件之一。根据不同的实验需求可以选择瞬时转染/感染和稳转细胞株构建。

瞬时转染/感染的特点:外源DNA不整合到宿主的染色体中,一个宿主细胞中可以存在多个拷贝数,产生短时间内的高水平的表达(只能持续几天);外源基因的表达水平不存在整合位点的问题,不会受到周围染色体元件的影响;瞬时转染所需的人力和时间比稳转少,但DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大,因此表达不长久也不稳定。

稳转细胞株的特点:经合适的药物浓度进行药物筛选后,可得到外源DNA整合到宿主染色体的细胞这些细胞可以长时间表达外源目的基因,稳定表达细胞株弥补了瞬时感染(或转染)实验中外源基因表达时间短的缺陷,便于长期观察。稳转细胞的筛选需根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,常用的抗性筛选有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、灭稻瘟素(Blasticidin)等。若实验需求构建稳转细胞株,我们建议通过慢病毒感染细胞进行药物筛选的方法,此方法较质粒转染可以更加有效的将外源基因整合入基因组,且整合位点处于转录相对活跃的区域,从而获得更加高效表达外源基因的稳转株细胞。


技术应用


如秩序要观察外源基因表达后较短时间内就能亚博电竞唯一官网的细胞功能,可使用瞬时转染/感染。即在转染后2496小时内收获细胞;如需要长期观察外源基因表达的作用,进行长期药理学研究、基因治疗研究、遗传调控机制研究或需要进行大规模蛋白合成则需要构建稳转株。


实验流程





实物

数据信息

实验周期

客户提供

细胞株(冻存株/培养细胞),目的

基因的质粒/菌株,目的蛋白抗体

目的基因的NIBI登录号、目的基因的载体信息、细胞培养信息

15周

我们提供

稳转细胞株T25一瓶和其冻存株一支

基本实验步骤、细胞培养,筛选照片以及qPCR和WB亚博电竞唯一官网结果


实验结果展示


图 1 稳转细胞株成功案例


TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

GFP阴性对照慢病毒感染细胞无荧光?


细胞状态不佳

细胞状态调整良好且细胞密度合适。

病毒感染细胞条件不适合

采用梯度浓度的慢性毒感染细胞,摸索合适的病毒感染细胞的比例,并考虑是否加polybrene

稳转细胞株状态变差?

传代次数过多

采用10代以内的细胞尽快完成实验,尽量防止反复冻存复苏操作。

稳转细胞株中表达GFP的细胞变少?

出现非抗性细胞

适当增加抗生素浓度。

质粒转染细胞效率过低?

质粒DNA的纯度

无内毒素污染的高纯度的质粒。

转染试剂

选择适合靶细胞的转染试剂并摸索转染试剂与质粒的混合比例。

细胞状态

细胞状态良好,细胞密度适合。

更换基因导入方式

更换基因导入方式对于难转染细胞建议采用病毒介导。


常见问题 FAQ


Q:外源基因导入哺乳动物细胞的常见方法 有哪些?

A外源基因导入哺乳动物细胞是目前基因治疗的关键步骤,理想的方法应具备如下特点:高效、安全、低细胞毒性且方法简单省时、经济。常见方法及比较请见下表:


常见方法

原理

优缺点

脂质体转染

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。

最常用的转染方法,体外对部分细胞有很高的效率;在体内迅速被血清清除,会产生一定毒性。

阳离子聚合物转染

阳离子聚合物可以与DNA形成稳定的复合物保护DNA免受核酸酶的降解。

日益收到重视,但受到细胞类型的局限,出现转染效率不高和细胞毒性的情况。

纳米聚合物转染

纳米级别的高分子阳离子聚合物可与DNA混合形成纳米复合物。

更加高效安全且细胞毒性低,更有独特的荧光示踪功能,各个公司已推出商品化产品,能否使用各种难转染细胞还有特验证。

病毒感染

以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中的生物学方法。

可用于难转染的细胞、原代细胞,体内动物实验等,常用慢病毒感染宿主细胞后将外源基因整合到染色体中构建稳转株。需要根据细胞类型选择合适的病毒类型,病毒载体的构建及包装过程需要1-2个月的周期和一定的人力物力。

电穿孔法

高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入细胞。

需要仪器设备,且对细胞的损伤较大,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。

磷酸钙法

磷酸钙与DNA复合物吸附细胞膜从而被细胞内吞。

可对易转染细胞如293T细胞达到较高的转染效率,但非常不稳定,重复性差,受实验条件的影响很大。

显微注射法

用显微操作技术将DNA直接注入靶细胞核。

转染率较高,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。需要昂贵的仪器,在导入DNA时需要进行单个细胞地注射,不适合大量细胞研究的需要。


Q:如何选择构建稳转株还是瞬时转染/感染?

A:根据外源基因能否整合宿主基因组DNA,可分为稳定转染和瞬时转染。如果需要观察外源基因表达后较短时间内就能亚博电竞唯一官网的功能,可以使用瞬时转染,即在转染后2496小时内收获细胞;如果想长期观察外源基因表达对于细胞功能的影响则需要构建稳转株。稳定转染需要进行细胞的筛选工作,与瞬时转染相比时间长、工作量大,请根据实验需求选择合适的转染方式。


Q:为什么推荐采用慢病毒感染而不是质粒转染的方式构建稳转株?

导入方式

导入靶细胞效率

整合位点

慢病毒感染

具备宿主范围广、感染效率高的特点

外源基因阅读框可完整高效的整合至宿主基因组的转录活跃区域,有利于外源基因的高效转录与表达

质粒转染

对于难转染细胞转染效率较低会导致整合几率极低,故稳定细胞株构建耗时耗力,阳性率很低

整合位点随机,且不能保证完整的阅读框架整合至宿主基因组中


Q:如何确认靶细胞可以进行慢病毒介导的稳转株构建?

A:首先对细胞进行慢病毒感染的MOI值摸索实验,即确认慢病毒与细胞感染的合适比例,以进行后续稳转株构建。将靶细胞接种至96孔板中,我们设定6-8个不同梯度的慢病毒MOI值感染靶细胞(进行加和不加polybrene的亚博电竞唯一官网),并取易感染的293细胞作为阳性对照。荧光显微镜下观察靶细胞EGFP荧光率,拍照记录各组MOI值下感染效率,确定感染效率达到80%以上的最佳MOI值。


Q:过表达稳定细胞株构建好之后,会出现qPCR及WB亚博电竞唯一官网目的基因没有过表达的情况吗?

A:我们会首先进行目的基因瞬时感染靶细胞后的qPCR和WB亚博电竞唯一官网,没有问题再进行过表达稳定细胞株的药物筛选工作。如果担心抗体质量的问题没有亚博电竞唯一官网到过表达建议客户可以在靶蛋上融合蛋白标签。稳转株构建经药物筛选完成后如果aPCR和WB亚博电竞唯一官网没有过表达,是不允许交货到客户手中的,即我们确保上海锐赛提供的稳定细胞株经过qPCR和WB确切验证有明显的外源基因表达。


Q:稳定细胞株靶蛋白经qPCR和WB亚博电竞唯一官网有过表达但是相关功能未能得到阳性结果?

A:首先我们确保载体中靶蛋白对应的核苷酸序列经测序验证序列正确,且阅读框正确无误,与标签蛋白融合无误,并且通过qPCR和WB的验证,另外外源基因在哺乳动物细胞表达中一般都可以进行正确的转录翻译,且翻译后的蛋白能够进行复杂的蛋白折叠和修饰,接近天然蛋白的结构。以上前提条件正确建立后,若蛋白本身未能获得预期的功能,需要确认功能实验的方法,比如是否设定阳性对照,实验方案设计是否合理等,并且多查找相关文献确认是否是有其他因素导致功能实验未获得阳性结果。


Q:收到的稳定细胞株,能够维持多久?

A:客户获得的稳转株一般需在药物筛选浓度值的-半进行维持培养,一般可进行10代以内的亚博电竞唯一官网工作,建议客户尽快进行相应的功能亚博电竞唯一官网实验,不要反复存复苏。如果长期培养不慎污染,或细胞状态差都会影响外源基因的表达。


Q:为什么同一种细胞的阴性对照稳转株构建过程快于目的基因的稳转株构建过程?

A:外源蛋白的过量或内源蛋白的过低表达往往会影响到宿主细胞的生长状态,因此往往阴性对照细胞的构建过程要快于外源基因的过表达或内RNAi稳转株。


Q:单克隆稳转株与混合稳转株有何区别?

A:单克隆稳转株是含有稳定整合外源片段的单个胞的扩增,而混合稳转株则是由多个单克隆稳转核构成的克,不同的单克隆其外源片的整合位点不一样,表达效率也不同。由于体外细胞多属病胞系,其基因组呈现不确定的特点,因此即使是同类细,不同细胞个体基因组背景都存在差异。当需去除细胞群体干扰因素的时候,推荐使用单克隆稳定细胞株,其基因组背景相对单一,对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时,多考虑这类因素。时也是由于不同细胞个体异大,而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细行为可能不一,所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。


参考文献

1.R.Ian Freshney. Culture of AnimalCells:A Manualof Basic Technique and Specialized Applications[M].Wiley-Blackwell Press,2011.

2.David L.Spector,Robert D.Goldman, Leslie A. Leinwand.Cells:a Laboratory manual[M].Cold Spring Harbor Labrotary Press,1998.


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