锐赛生物

靶标发现与功能验证基因操作和基因组编辑药物靶标开发生化/细胞水平验证高通量高内涵分析GPCR/核受体亚博电竞唯一官网激酶亚博电竞唯一官网体外药理学体外安全性评价药代动力学毒理学评价药代动力学/毒理学抗肿瘤药理评价代谢类和心脑血管疾病药理评价中枢神经系统药理评价炎症/自身免疫疾病药理评价体内药理学立项成果展示肿瘤个性化治疗项目QPCRWB亚博电竞唯一官网ELISA亚博电竞唯一官网甲基化亚博电竞唯一官网SNP亚博电竞唯一官网高效液相色谱法(HPLC)蛋白质谱基因芯片核酸、蛋白分析服务目的基因的ORF克隆化学合成质粒载体构建siRNA的细胞转染及筛选技术服务shRNA载体构建及筛选技术服务RNAi病毒包装及筛选技术服务miRNA的表达载体构建及病毒包装载体构建及筛选服务chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀实验服务慢病毒包装腺病毒包装细胞培养原代细胞分离干细胞诱导分化CCK-8亚博电竞唯一官网流式周期亚博电竞唯一官网流式凋亡亚博电竞唯一官网流式分选细胞流式鉴定细胞表面抗体活性氧(ROS)亚博电竞唯一官网线粒体膜电位亚博电竞唯一官网transwell亚博电竞唯一官网管腔形成实验细胞黏附实验细胞克隆形成实验细胞免疫荧光亚博电竞唯一官网稳转株构建双荧光素酶亚博电竞唯一官网细胞干性成球能力磁珠分选细胞MDA(丙二醛)亚博电竞唯一官网酶活动力学亚博电竞唯一官网HDA亚博电竞唯一官网细胞实验服务常规化学染色免疫组化(IHC)免疫荧光(IF)原位杂交(ISH)荧光原位杂交(FISH)原位末端标记染色(TUNEL)组织样本处理拍照处理病理学亚博电竞唯一官网服务裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源肿瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管类疾病模型肾脏疾病模型肝脏疾病模型炎症与自身免疫疾病模型呼吸系统疾病模型其他疾病模型动物实验服务2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往期精品SCI漂亮SCI案例库科研转化成果u.cad癌症筛查亚博电竞唯一官网全外显子组基因亚博电竞唯一官网其他疾病基因亚博电竞唯一官网生物信息数据分析服务肿瘤学领域研究平台病理学中心实验室心血管与代谢领域疾病研究平台炎症与自身免疫疾病领域研究平台特发肺纤维化疾病领域研究平台抗体药物一体化临床前研发平台药性评价平台公司新闻价值金字塔三元悖论为客户赢得荣誉诚觅英才内部推荐加入我们留言板联系我们推荐朋友SCI论文发表奖励制度科研资助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 发光液细胞周期与凋亡亚博电竞唯一官网自研试剂基因质粒病毒免费送细胞库动物饲料促销活动

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双荧光素酶亚博电竞唯一官网

Luciferase assay



实验原理


miRNA通过碱基配对结合到靶mRNA的3’UTR区,抑制靶基因的翻译或对靶基因mRNA的降解达到调控基因表达的目的。将靶mRNA的3’UTR区构建至萤火虫荧光素酶报告基因的3’端,与miRNA表达载体及海肾荧光素酶报告基因载体共转染细胞,先后加入两种底物荧光素,通过对荧光素酶报告基因的表达亚博电竞唯一官网确认miRNA对靶基因的调控效果。下图为双荧光素酶报告基因亚博电竞唯一官网载体的示意图。


图6.5 双荧光素酶报告基因亚博电竞唯一官网系统示意图


技术应用


通过miRNA靶标的鉴定从而进行miRNA功能的深入研究。


实验流程




实物

数据信息

实验周期

客户提供

miRNA序列信息及靶点信息

10周

我们提供

质粒、菌株

基本实验步骤、测序报告、EXCEL原始数据



实验结果展示


图 1 hsa-miR-9-1 的靶点筛选结果
1)四组质粒的 293 细胞共转染后的细胞照片;2)四组细胞的双荧光素酶报告基因亚博电竞唯一官网柱形图。
注:WT为野生型3'UTR 区的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,Mut为突变型3'UTR 区的萤火虫荧光素酶报
告基因质粒,结果表明待研究的 miRNA 对靶基因有较明显的调控作用。


TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

发光亚博电竞唯一官网值过低?

荧光素酶表达多低

注意调整细胞状态、转染条件、转染量,提高发光值。

亚博电竞唯一官网试剂

避免反复冻融以及保存时间过长。

发光亚博电竞唯一官网值过高?

荧光素酶表达过高

建议通过降低转染量或减少亚博电竞唯一官网体积等降低发光


常见问题FAQ


Q :有哪些数据库可对miRNA的靶基因进行预测分析?

A :根据miRNA 5‘ 端2-8个核苷酸可与靶mRNA 3‘ UTR区完全互补这一特点,结合miRNA与靶基因形成二聚体的热力学稳定性和二级结构进行分析,有如下数据库的预测分析结果可供参考:


miRNA靶基因预测方法

亚博电竞唯一官网范围

算法特点

miRanda


人,果绳,斑马鱼


序列匹配,双链结合自由能,物种间保守性

TargetScan

/TargetScanS

人,小鼠,大鼠,狗,鸡,蛙,黑猩猩,恒河猴,牛,负鼠

提出“miRNA种子区”的概念

RNAhybrid

哺乳动物

快速准确计算miRNA-mRNA二聚体自由能

DIANA-microT

人,小鼠,大鼠,果绳

考虑miRNA调控单个靶位

点的情况

PicTar

脊椎动物

区分“完全匹配种子区”与“不完全匹配种子区”

RNA22

哺乳动物

不考虑保守性,由mRNA入手预测相miRNA



Q :荧光素酶报告基因有哪些特点?有哪些应用?

A :在荧光素酶的催化下,荧光素可被氧化并释放光子,可用荧光亚博电竞唯一官网仪对荧光定量测定。荧光素酶亚博电竞唯一官网系统具有非放射性,灵敏度高的特点。荧光素酶咋哺乳动物细胞中的半衰期为3小时,半衰期短不发生积累,故调控元件的改变会即时导致荧光素酶活性的改变,可进行快速方便的分析。我们把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在荧光素酶报告基因的上游或下游,构建成报告基因质粒,即可进行启动子、增强子的活性研究,miRNA的靶点筛选工作。


Q :荧光素酶的发光波长是多少?

A :萤火虫荧光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾荧光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。


Q :荧光素酶亚博电竞唯一官网系统需要制备标准曲线吗?

A :一般不需作标准曲线。荧光素酶亚博电竞唯一官网系统用于比较样品的相对活性。


Q:双荧光素酶报告基因系统有何优点?

A:在双荧光素酶报告基因测试中,将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因,海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达,而对照报告基因作为内对照,以使实验报告基因测试的结果归一化。作归一化可消除实验过程中减弱实验准确度的变化,如培养细胞的数量、细胞转染及裂解的效率等。


Q:荧光素酶报告基因与GFP的区别是什么?

名称

亚博电竞唯一官网方法

应用

特点

GFP绿色荧光蛋白

显微镜下直接观察

转染效率的亚博电竞唯一官网或融合目的蛋白,观察蛋白表达情况

方便直观

荧光素酶报告基因

细胞裂解后加入底物在荧光亚博电竞唯一官网仪中进行测定

研究启动子的功能与调控


可准确定量




参考文献

1. Lee DY, Deng Z,Wang CH, et al.MicroRNA-378 promotes cell survival, tumor growth, and angiogenesis by targetingSuFu and Fus-1 expression.PNAS 2007,(104):20350-20355.

2. Dong F, Lou D. MicroR NA-34b/c suppresses uveal melanoma cell proliferation and migration through multipletargets.Molecular Vision 2012,(18):537-546.

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